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免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發光物質、鐵蛋白和膠體金等。辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實驗是以辣根為原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。
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HRP的制備
1)水提取：稱取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。. K0 p3 I5 F1 U" R: J
2)硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內，放在流動自來水中進行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。 0 c4 N; R: ^/ ~: F! T$ J7 G
3)丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。
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工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
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