一、 原理
T淋巴細(xì)胞膜上具有異種動(dòng)物紅細(xì)胞的受體，可與綿羊等動(dòng)物的紅細(xì)胞(E)結(jié)合形成花環(huán)；B淋巴細(xì)胞膜上具有補(bǔ)體C3b受體，可與補(bǔ)體C3b致敏的酵母菌細(xì)胞(Y)形成花環(huán)；D細(xì)胞膜上具有以上兩種受體，故可同時(shí)與動(dòng)物紅細(xì)胞、補(bǔ)體C3b致敏的酵母細(xì)胞形成混合花環(huán)；N細(xì)胞無以上兩種受體，不形成花環(huán)。此試驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、D細(xì)胞及N細(xì)胞，借以了解機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平。
二、 材料和方法
(一) 材料
家兔脫纖血液，酵母多糖試劑，新鮮小鼠血清，豚鼠肝素抗凝血，滅活小牛血清，025%戊二醛，Hanks液及生理鹽水，姬姆薩氏染液與瑞氏染液。
(二) 方法
1 1%家兔紅細(xì)胞懸液的制備取脫纖血，用Hanks液洗3次，zui后一次用刻度尖底離心管，以2 000～2 500 r/min離心15min，棄去上清，用Hanks液配成1%(V/V)懸液，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，調(diào)至4×108/ml備用。
2 C3b致敏酵母細(xì)胞懸液的制備取酵母多糖試劑用生理鹽水洗2次，zui后一次用刻度尖離心管2 000～2 500 r/min離心10min，用生理鹽水配成1%懸液，再與等量小鼠血清充分混合均勻，置37℃水浴15min，其間不斷搖晃，以使其充分作用。之后用生理鹽水洗1次，再用生理鹽水配成1%懸液，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，調(diào)至1×108/ml備用。
3 淋巴細(xì)胞懸液的制備
(1) 取豚鼠肝素抗凝血2ml，加等量Hanks液進(jìn)行稀釋，輕輕加入裝有2 ml淋巴細(xì)胞分層液的試管上層，注意使之不要與分離液混合。
(2) 置水平離心機(jī)上以2000～2500 r/min離心15min，使淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞分開。吸取淋巴細(xì)胞層，用Hanks液洗1次，棄去上清，沉淀物懸浮后計(jì)數(shù)，用Hanks液調(diào)細(xì)胞數(shù)至1×107/ml備用。
4 花環(huán)形成試驗(yàn)
(1) 于同一試管中加入1×107/ml的淋巴細(xì)胞懸液、滅活小牛血清、1×108/ml C3b致敏酵母細(xì)胞懸液和4×108/ml家兔紅細(xì)胞懸液各2滴，充分混勻，置37℃水浴15min，取出后以500 r/min離心5min，置4℃冰箱過夜。
(2) 取出后，吸棄少許上清，用腕力輕輕懸浮后，加入025%戊二醛1小滴，再充分混勻，涂片，自然干燥，甲醇固定，再用姬姆薩氏染液與瑞氏染液分步染色：先將姬姆薩氏染液用pH值64 PBS稀釋一倍，染1～2min后水洗，再加用pH值64 PBS稀釋一倍的瑞氏染液，染1～2min，水洗干燥后，用油浸鏡或高倍鏡觀察計(jì)數(shù)。
三、 結(jié)果
鏡檢計(jì)數(shù)，見粘附3個(gè)以上紅細(xì)胞者為T淋巴細(xì)胞；粘附3個(gè)以上C3b致敏酵母細(xì)胞者為B淋巴細(xì)胞；同時(shí)粘附2個(gè)以上紅細(xì)胞和2個(gè)以上C3b致敏酵母細(xì)胞者為D細(xì)胞；無細(xì)胞粘附者為N細(xì)胞或其它細(xì)胞。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，算出各種細(xì)胞的百分率。有資料表明：豚鼠EY混合玫瑰花環(huán)中，T細(xì)胞20%，B細(xì)胞8%，D細(xì)胞1%，其它細(xì)胞為62%。
四、 注意事項(xiàng)
1 酵母多糖(zymosan)是從酵母細(xì)胞中提取的一種脂多糖，在體外能激活血清補(bǔ)體的旁路途徑，并與裂解的補(bǔ)體C3b結(jié)合形成酵母多糖補(bǔ)體復(fù)合物。應(yīng)用的小鼠血清為多個(gè)體的血清混合物，并要求血清新鮮。
2 本試驗(yàn)條件要求固定，被檢淋巴細(xì)胞、C3b致敏酵母細(xì)胞、紅細(xì)胞的比例，控制在1∶10∶40水平上。比例過大或過小，形成花環(huán)率都不準(zhǔn)。這可能與淋巴細(xì)胞表面受體的數(shù)量有關(guān)。
3 在不吸附任何細(xì)胞的其它細(xì)胞中，除N細(xì)胞外，可能還包括幼稚型的T、B淋巴細(xì)胞和其它沒有紅細(xì)胞和C3b受體的細(xì)胞以及沒有粘附的T、B淋巴細(xì)胞。
4 加入戊二醛主要是起偶聯(lián)作用，過多會(huì)使玫瑰花環(huán)率升高，加入時(shí)要控制用量。戊二醛用pH值64 PBS稀釋。
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